- Количественный анализ нуклеиновых кислот
-
Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе используют спектрофотометрический метод и УФ-флюоресценцию, если нуклеиновая кислота содержит краситель.
Содержание
Спектрофотометрический анализ
Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.
При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)−1 cm−1, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)−1 cm−1 и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)−1 cm−1). Отсюда, оптическая плотность (англ. OD, optical density) равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD.[1] Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего сосдества.[2]
Коэффициенты пересчета
Тип нуклеиновой кислоты Концентрация (мкг/мл) для 1 единицы A260 dsDNA (двуцепочечная ДНК) 50 ssDNA (одноцепочечная ДНК) 37 ssRNA (одноцепочечная РНК) 40 Кюветы для анализа
Для определения концентрации образца, оптическую плотность, определённую при помощи стандартной кюветы с величиной оптического пути 10 мм, необходимо умножить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.
Кюветы малого объема
Для многих биологических исследований требуется (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры[3] позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.
Чистота образца
Часто образцы нуклеиновых кислот содержат примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A260/230 около 2.
Примеси белков и отношение 260:280
Для выявления примесей белков в растворах нуклеиновых кислот, анализируют соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм, ароматические аминокислоты в составе белков поглощают на 280 нм.[1][4] Однако вклад примесей белков в определение концентрации нуклеиновых кислот небольшой — для того, чтобы повлиять на соотношение 260:280 в растворе нуклеиновой кислоты, концентрация белка должна быть значительной.[1][5]
Отношение 260:280 позволяет определить примесь нуклеиновых кислот в растворах белков и примесей белков в растворах нуклеиновых кислот:
% белка % нуклеиновой кислоты отношение 260:280 100 0 0,57 95 5 1,06 90 10 1,32 70 30 1,73 В случае определения примеси белка в растворе нуклеиновой кислоты отношение 260:280 имеет меньшую чувствительность :
% нуклеиновой кислоты % белка отношение 260:280 100 0 2,00 95 5 1,99 90 10 1,98 70 30 1,94 Такие отличия обусловлены более высоким значением коэффициента молярной экстинкции в случае нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм, в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Определение белкового загрязнения в растворе нуклеиновой кислоты не может быть определен по соотношению 260:280, поэтому примеси белков в растворах нуклеиновых кислот вносят незначительную погрешность в определение концентрации ДНК и РНК.
Другие загрязнения
- Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A260/280 около 1.2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A260/280 около 2.[1] Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК.
- Поглощение на длине волны 230 нм могут быть вызваны загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A260/230 около 1,8.[6]
- Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю.
- Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank). Также отрицательные значения могут быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.
Примечания
- ↑ 1 2 3 4 Sambrook and Russell Molecular Cloning: A Laboratory Manual. — 3rd. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. — ISBN 978-087969577-4
- ↑ Tataurov A.V.; You Y., Owczarzy R. (2008). «Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids». Biophys. Chem. 133 (1-3): 66–70. DOI:10.1016/j.bpc.2007.12.004. PMID 18201813.
- ↑ Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, October 7), American Biotechnology Laboratory, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf
- ↑ Sambrook and Russell cites the original paper: Warburg, O. and Christian W. (1942). «Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase». Biochem. Z. 310: 384–421.)
- ↑ Glasel J. (1995). «Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios». BioTechniques 18 (1): 62–63. PMID 7702855.)
- ↑ The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com (13 января 2010). Архивировано из первоисточника 6 сентября 2012. Проверено 12 марта 2010.
Категории:- Фотометрия
- Методы молекулярной биологии
- Нуклеиновые кислоты
Wikimedia Foundation. 2010.